注射器的微生物侵入试验
微生物侵入试验的试验目的是用微生物挑战试验-液体浸没法检测预灌封注射器的完好性。将三批产品各50支浸在含有高浓度(大于106cfu/mL)的铜绿假单胞菌运动性细菌菌悬液中。培养这些预灌装注射器容器并检查是否有挑战微生物铜绿假单胞菌侵入。
6.5.5.1侵入试验前样品的无菌检查(每批用20支样品)
1) 胰酪胨大豆肉汤培养基每管装量分别15 mL,400 mL /瓶经121℃、15分钟高压灭菌。用于无菌检查、培养基的灵敏度检查、菌悬液增菌制备。
2) 将20支规格为5g的盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶依次编号为1.2.3.4.5………20,同样再将20支装有15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基管依次编号为1.2.3.4.5……….20,在无菌条件下,用推杆缓慢将编号为1.2.3.4.5………20的盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶1 g,直接加入编号1.2.3.4.5…….2 0的胰酪胨大豆肉汤培养基管,接种后轻轻摇动,使混匀。取含15 mL已灭菌的胰酪胨大豆肉汤培养基空白管1支为阴性对照管。
3) 所有胰酪胨大豆肉汤培养基管于30~35℃培养14天,观察结果。将无菌检查结果填入无菌检查结果记录在“测试报告7”中,可接受标准为应无菌。
6.5.5.2 侵入试验前样品培养基的灵敏度检查
1) 无菌检查培养14天后,所有培养基管都应无微生物生长,取上述混合后的20支试管,每个试管内接种0.1 mL(0.1 mL含10~ 100cfu)的挑战试验用微生物—铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌悬液。在30~35℃下培养7天。如在7天内,所有接种试管内的微生物生长良好,则说明试管内培养基营养符合要求,盐酸利多卡因透明质酸钠凝胶供试品无抑菌作用。
2) 使用革兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质,来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。将培养基的灵敏度检查结果填入“测试报告8”,应合格。
6.5.5.3挑战菌悬液的制备
1)从铜绿假单胞菌的新鲜斜面上取一整环培养物,分别接入6个含10 mL胰酪胨大豆肉汤无菌培养基的试管中,在30~35℃下,增菌16~18小时。
2)将6管的培养物分别转入盛有400 mL胰酪胨大豆肉汤培养基的6个锥形瓶中,于30~ 35℃下培养22~24小时。在培养结束时,能明显见容器内培养基混浊。培养结束后的菌悬液用来挑战预灌装注射器密封件的完整性。
3)将新鲜的挑战微生物菌悬液倒入已灭菌的3000 mL 的烧杯容器中,混匀。取1 mL菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成小于300 cfu/ mL的菌悬液进行计数,每步稀释10倍,用胰酪大豆胨琼脂培养基计数,培养48小时。测定的菌悬液浓度大于106cfu/ mL,细菌在显微镜下观察细胞处于生长状态,并且运动活跃,活动性细胞应占90%以上,同时确认生长的微生物就是挑战试验用微生物铜绿假单胞菌。
4)在“测试报告9”中记录菌悬液的制备结果。菌悬液的制备结果应大于106 cfu/mL。
6.5.3.4 微生物侵入试验操作步骤
本试验须在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。
1)将新鲜的挑战菌悬浮液分成三份(以下简称菌悬液)倒入合适的容器中。将三批每批各50支试样(用金属丝固定,10个一捆,共5捆)侵入菌悬液中,应充分接触注射器胶塞和护帽表面,整个试样注射器的外表面应完全浸泡在菌悬液中。试验开始时取一份菌悬液,平板计数每毫升所含的活菌数。并要确认试验用微生物是铜绿假单胞菌。
2)将试样至菌悬液中持续浸泡4h。从菌悬液中取出试样,用无菌注射用水冲洗外表面,(淋洗后的水及用具需要进行121℃、30分钟高压灭菌)擦干试样外壁,然后用75%乙醇消毒外表面,做为挑战试验用的试样。侵入试验结束时,再次用平板计数菌悬液的浓度。与试验开始相比,浸泡结束时的活菌数如有减少,浸泡结束菌悬液浓度对数值的降低应小于1。
3) 取每支挑战试验试样各1 mL分别接入15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基中,在30~ 35℃下培养14天进行无菌检查,另取2支没有浸过菌液的试样按照2)淋洗后,取每支试样1 mL分别接入至2支15 mL的胰酪胨大豆肉汤培养基中,每支再接种10~100 cfu铜绿假单胞菌菌悬液0.1 mL,在30~ 35℃下培养7天,作为阳性对照。
4)将挑战试验用的试样及阳性对照试样分别培养14天和7天,观察每一试样内微生物的生长情况。假如试样长菌,应确认生长菌是否是挑战微生物-铜绿假单胞菌。
5)假如挑战试验用的试样都不长菌,则从挑战试验用的试样中,每个批次取10个试样,依照6.4.5.2方法进行侵入试验前样品培养基的灵敏度检查试验。
6)试验结果记录在“测试报告10”微生物侵入测试记录、“测试报告11”侵入试验阳性对照检查、“测试报告12”侵入试验后培养基灵敏度检查、“测试报告13”微生物侵入试验中。
6.5.3.5 可接受标准
挑战试验用的试样应无微生物生长,阳性对照应有微生物生长,挑战试验合格的样品培养基的灵敏度检查应合格,试验结果记录在“测试报告14”中。